Количественная оценка метаболической активности Ascaris suum L3 с использованием восстановления резазурина

Паразиты и переносчики, том 16, Артикульный номер: 243 (2023) Цитировать эту статью

365 доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Гельминтные инфекции являются важной проблемой общественного здравоохранения среди людей и оказывают еще большее влияние на благополучие домашних животных и скота. Текущие показатели скрининговых анализов антигельминтных препаратов включают стадию развития, миграцию или подвижность, которые могут быть субъективными, трудоемкими и малопроизводительными. Целью данного исследования было применение и оптимизация флуорометрического метода с использованием резазурина для оценки изменений метаболической активности личинок Ascaris suum третьей стадии (L3), паразита, имеющего большое экономическое значение у свиней.

Ascaris suum L3 механически выводили из яиц с эмбрионами сроком от 6 до 8 недель, обогащенных градиентом сахарозы. Краситель резазурин и A. suum L3 титровали в 96-луночных микротитровальных планшетах, а активность восстановления резазурина оценивали с помощью флуорометрии после 24 часов инкубации. Для локализации места восстановления резазурина внутри личинок использовали флуоресцентную микроскопию. Наконец, мы подвергли A. suum L3 различным стрессовым условиям, включая жару, метанол и антигельминтные средства, и исследовали их влияние на метаболизм личинок за счет активности снижения резазурина.

Мы показываем, что нефлуоресцентный краситель резазурин восстанавливается внутри жизненно важного A. suum L3 до флуоресцентного резоруфина и высвобождается в культуральную среду. Оптимальные параметры анализа: 100–1000 л3 на лунку, концентрация резазурина 7,5 мкг/мл и инкубация при 37 °C/5% CO2 в течение 24 часов. Неповрежденная оболочка L2 вокруг L3 A. suum полностью предотвращает поглощение резазурина, тогда как в непокрытой оболочке L3 наиболее интенсивный сигнал флуоресценции наблюдается вдоль средней кишки личинки. L3, подвергшийся воздействию метанола или тепла, демонстрирует постепенное снижение активности восстановления резазурина. Кроме того, 24-часовое воздействие ивермектина в концентрации 0,625 мкМ, мебендазола в концентрации 5 мкМ и тиабендазола в концентрации от 10 до 100 мкМ значительно снижало метаболическую активность личинок на 55%, 73% и с 70% до 89% соответственно.

В совокупности наши результаты показывают, что как метаболические стрессоры, так и антигельминтные препараты значительно и воспроизводимо снижают активность восстановления резазурина A. suum L3, что делает предлагаемый анализ чувствительным и простым в использовании методом оценки метаболической активности A. suum L3 in vitro. .

Борьба с желудочно-кишечными нематодами в первую очередь зависит от химиотерапии как у людей, так и у животных. Однако повторяющиеся методы лечения и повторные инфекции, ограничение доступных в настоящее время классов антигельминтных препаратов [49], увеличение количества сообщений о снижении эффективности лекарств и развивающаяся резистентность к антигельминтным средствам первой линии, таким как бензимидазолы и ивермектин, повышают осведомленность о важности исследований противогельминтных препаратов [19, 22]. , 30, 38]. Быстрому открытию новых препаратов против почвенных гельминтов (ГПГ) в основном препятствует отсутствие объективных высокопроизводительных методов скрининга для оценки эффективности препаратов [1, 20, 47].

Микроскопическая оценка подвижности и морфологии доминирует в используемых в настоящее время методах оценки эффективности лекарств на личинках. Эти подходы, как правило, отнимают много времени, трудоемки и склонны к субъективизму, поэтому не подходят для высокопроизводительного скрининга. Такие устройства, как система xCELLigence [40] и wMicroTracker System™ [24, 37], были проверены для высокопроизводительного скрининга лекарств на Caenorhabditis elegans и нескольких видах паразитических гельминтов, однако считывание данных полностью ограничивается двигательной активностью. Поэтому обсуждаются комбинаторные подходы, которые учитывают несколько параметров при скрининге новых кандидатов на лекарственные средства, такие как общие показатели, такие как двигательная активность, в сочетании со специфическими показателями предполагаемого способа действия, такими как электрофизиологическая или метаболическая активность [12].

Помимо подвижности, жизнеспособность нематод можно оценить с помощью индикаторных красителей метаболической активности, которые на личиночных стадиях превращаются в измеримый продукт. На гельминты были протестированы различные метаболические индикаторы, такие как тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (МТТ), диацетат флуоресцеина (FDA), пара-нитрофенилфосфат (pNPP). ) [34] и проницаемый для клеток краситель резазурин. Ресазурин основан на НАДФН-зависимом восстановлении резазурина до резоруфина и широко используется для мониторинга роста клеток млекопитающих и клеточного метаболизма в широком диапазоне мишеней [23]. К настоящему времени анализ снижения резазурина был адаптирован для скрининга лекарств у взрослых видов Schistosoma [25, 26], а также у личинок четвертой стадии (L4) и взрослых Trichuris muris [39]. Насколько нам известно, данные о потенциале анализа восстановления резазурина у Ascaris spp. parasites отсутствует, хотя это один из наиболее распространенных ГППП во всем мире как у человека, так и у свиней [15, 17, 51].

95%. Of note, larvae inside eggs that we obtained from both the 23% and 25% sucrose layers appeared fully embryonated and were therefore pooled and used for all subsequent in vitro assays./p> 0.99). For larvae treated with 1.5 vol% methanol for 24 h, no significant impact on resazurin reduction activity was detected. However, gradual impairment of resazurin reduction activity was observed at concentrations of 3%, 6%, and 12%, resulting in significantly weaker fluorescence signals by 20% (P ≤ 0.05), 45% (P ≤ 0.0001), and 70% (P ≤ 0.0001), respectively. Methanol at 25% completely abrogated resazurin reduction. In the control, methanol itself at concentrations of 25% did not notably change fluorescence characteristics of resorufin (Additional file 2: Fig. S2). A gradual decrease in resorufin production was measured with increasing methanol concentrations. Four-parameter logistic regression revealed a half-maximal effective concentration (EC50) = 6.8% (df = 26, R2 = 0.95, 95% CI for EC50 = 4.3–9.2%) for methanol (Additional file 3: Fig. S3). Overall, for A. suum L3 exposed for increasing times to 60 °C or increasing methanol concentrations, we observed a gradually measurable decrease in resazurin reduction activity in the larvae./p>

1.14 mM in A. suum L4 (intestinal isolates 14 days post-infection). However, we were not able to reproduce an ivermectin concentration of 1.14 mM without precipitation of the drug in 0.5% DMSO. Therefore, we titrated ivermectin in 0.5% DMSO (in H2O) and detected turbidimetrically its maximum solubility at 1.56 µM in H2O (Additional file 4: Table S1). Moreover, the solubility of ivermectin in HBSS-AB was lower due to medium components like salts, sugar and antibiotics, which reduced the maximum soluble concentration to 625 nM. At this concentration of ivermectin, we observed 55% reduction in the activity of resazurin reduction in the L3, which consequently indicates a considerably lower EC50 value for A. suum L3 than for A. suum L4 observed by Hu et al. [16]. Hansen et al. [14] reported for ivermectin an IC50 of ~ 1 µM in A. suum L3, which is closer to our observations. However, for C. elegans, significant effects were observed at considerably lower ivermectin concentrations (0.6–20 nM ivermectin) [3, 12]. On the one hand, this may indicate that the resazurin reduction assay is less sensitive for detecting the effects of ivermectin on A. suum L3 compared to in vitro assays in other nematodes. On the other hand, together with the observations from Hu et al. [16] and Hansen et al. [14], it is conceivable that A. suum larvae are less susceptible to ivermectin than C. elegans larvae. The impact of thiabendazole and mebendazole on A. suum L3 have been investigated so far by Zhao et al. [50], who reported an EC50 values in the range of 2.3–150 nM using an agar migration assay for drug effect evaluation after 24 h drug treatment. However, 1000-fold higher concentrations of these anthelmintics resulted in significant but not complete inactivation of resazurin reduction activity by 73% to 89% in the present study. The direct comparison of the studies is difficult because the drug effects were evaluated using different methods. However, the resazurin reduction assay might be less sensitive in detecting impairments of larval locomotion rather than the agar migration assay but might provide a better sensitivity for detecting impairments of larval metabolic activity./p>

3.0.CO;2-Z" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-010X%2819990701%29284%3A2%3C147%3A%3AAID-JEZ4%3E3.0.CO%3B2-Z" aria-label="Article reference 18" data-doi="10.1002/(SICI)1097-010X(19990701)284:23.0.CO;2-Z"Article CAS PubMed Google Scholar /p>