Быстрая идентификация Staphylococcus aureus на основе платформы флуоресцентной визуализации/обнаружения, которая сочетает в себе метод петлевой изотермической амплификации и смартфон.

Том 12 научных отчетов, номер статьи: 20655 (2022) Цитировать эту статью

1435 Доступов

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Заболевания, связанные с пищевыми продуктами, представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению в Соединенных Штатах. Риски для здоровья, связанные с пищевыми патогенами, обуславливают необходимость постоянного мониторинга пищевых продуктов. Эффективный метод, позволяющий быстро диагностировать пищевые патогены, будет иметь неоценимое значение и будет пользоваться большим спросом. В этом исследовании мы показали возможность создания новой платформы быстрого обнаружения, основанной на флуоресцентной визуализации/обнаружении, которая сочетает в себе удобное в использовании портативное устройство для реакции изотермической амплификации с помощью петли (LAMP) и систему обнаружения на базе смартфона. Предлагаемая платформа была использована для обнаружения золотистого стафилококка, который является одним из наиболее важных патогенов пищевого происхождения, особенно молочных продуктов. Полный протокол работает быстрее; реакция проводится в изотермических условиях и завершается за 1 час или менее. Экспериментальные результаты показывают, что анализы LAMP были в десять раз более чувствительными, чем обнаружение на основе ПЦР. Предложенная система обнаружения смартфонов смогла обнаружить и количественно оценить образцы анализа LAMP, содержащие три различные концентрации S. aureus: от 109 КОЕ/мл до 103 КОЕ/мл. Настоящее исследование, подтверждающее концепцию, показало, что эта платформа предлагает портативный и простой в использовании метод измерения целевых патогенов с помощью LAMP-амплификации.

Пищевые патогены определяются как биологические агенты, вызывающие болезни пищевого происхождения; это могут быть вирусы, бактерии и эукариоты, такие как грибы, простейшие или гельминты1. Ежегодно Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) сообщает о вспышках заболеваний, связанных с пищевыми патогенами; например, в 2020 году оно сообщило о заражении Escherichia coli, Listeria monocytogenes и Cyclospora в ростках клевера, грибах эноки и салате в пакетиках соответственно (FDA 2020). Риски для здоровья, связанные с пищевыми патогенами, обуславливают необходимость постоянного мониторинга пищевых продуктов. Для обнаружения микробных патогенов общепринятым методом является рост бактерий на культуральной среде, а затем на селективном агаре; иногда это включает биохимическое или серологическое тестирование. Этот процесс имеет некоторые недостатки, поскольку он требует много времени, трудоемок и невозможно обнаружить некультивируемые патогены2. При использовании традиционной методологии выявление E. coli O157 занимает около 3 дней, Salmonella — 4–6 дней, а Vibrio parahaemolyticus — около 7 дней3. По этой причине появились новые методы, которые обеспечивают более быстрые, надежные и чувствительные результаты; некоторые из наиболее широко используемых — это полимеразная цепная реакция (ПЦР) и петлевая изотермическая амплификация (LAMP). В ПЦР процесс амплификации включает повторение трех температурных этапов. Первый этап соответствует денатурации двухцепочечной ДНК, второй этап включает гибридизацию праймеров и последний этап представляет собой удлинение ДНК4. После 35–40 циклов можно получить от тысяч до миллионов копий, начиная с одной копии ДНК в качестве матрицы5.

С помощью ПЦР были выявлены разнообразные патогены в пищевых продуктах; среди них E. coli6, Salmonella7, V. parahaemolyticus8, C. perfringens9 и L. monocytogenes10. Тем не менее, для проведения ПЦР необходима машина ПЦР, а продукт необходимо загрузить в агарозный гель, окрасить красителем и визуализировать в УФ-свете11. Эти ограничения делают ПЦР трудным методом для использования в полевых условиях.

С другой стороны, метод LAMP, разработанный Нотоми и др.12, амплифицирует ДНК за счет использования четырех праймеров, которые распознают шесть различных последовательностей в целевой ДНК. Полный протокол работает быстрее; реакция проводится в изотермических условиях и завершается за 1 ч или менее13. Пищевыми патогенами, выявленными с помощью этого метода, являются Salmonella14, S. aureus15, Campylobacter16 и L. monocytogenes17. В этом исследовании мы продемонстрировали, что реакция LAMP обладает высокой чувствительностью для обнаружения образцов S. aureus с различными концентрациями. Реакцию LAMP можно анализировать с помощью электрофореза в агарозном геле или других методов обнаружения. Однако эти методы обнаружения после амплификации требуют открытия реакционных пробирок, что увеличивает риск загрязнения проб. Чтобы снизить этот риск, продукты амплификации LAMP можно визуализировать с помощью сигнала флуоресценции, добавляя различные красители, такие как SYBR зеленый, кальцеин, SYTO 9 или берберин18,19,20. Некоторые красители позволяют идентифицировать положительный или отрицательный образец невооруженным глазом по изменению цвета. Например, использование наночастиц золота в LAMP приводит к изменению цвета с прозрачного на розовый при положительных реакциях21. С другой стороны, использование гидроксинафтолового синего (HNB) демонстрирует фиолетовую окраску при отрицательных реакциях по сравнению с синей окраской при положительных реакциях19. Другим методом обнаружения является анализ мутности, возникающей в результате осаждения пирофосфата магния, который является побочным продуктом реакций LAMP22. В этом исследовании мы показали, что применение красителей, таких как HNB, который можно увидеть невооруженным глазом, и красителя SYBR Safe, для которого нужен только синий свет, является простым способом визуально отличить положительные и отрицательные результаты.