Новые взгляды на роль длинных не | Нанкинская компания ПЦР-пластин, ООО

Nature Communications, том 14, номер статьи: 5086 (2023) Цитировать эту статью

1122 Доступа

9 Альтметрика

Подробности о метриках

Сложный жизненный цикл Plasmodium falciparum требует скоординированной регуляции экспрессии генов, чтобы обеспечить инвазию, передачу и уклонение от иммунитета в клетку-хозяина. В настоящее время появляется все больше данных, свидетельствующих о важной роли эпигенетических механизмов в экспрессии генов у паразита. Было идентифицировано, что у эукариот многие днРНК являются ключевыми регуляторами структуры генома и экспрессии генов. Чтобы изучить регуляторную роль днРНК у P. falciparum, мы исследуем межгенное распределение днРНК в ядерных и цитоплазматических субклеточных местах. Используя профили экспрессии зарождающихся РНК, мы идентифицируем в общей сложности 1768 днРНК, из которых 718 (~41%) являются новыми у P. falciparum. Субклеточная локализация и стадийно-специфическая экспрессия нескольких предполагаемых днРНК подтверждены с помощью RNA-FISH. Кроме того, с помощью ChIRP исследуется заселенность всего генома несколькими ядерными днРНК-кандидатами. Результаты показывают, что сайты оккупации днРНК являются фокальными и специфичными для последовательностей с особым обогащением нескольких семейств генов, специфичных для паразитов, включая те, которые участвуют в патогенезе и половой дифференциации. Геномный и фенотипический анализ одной конкретной днРНК демонстрирует ее важность в половой дифференциации и размножении. Наши результаты выводят на новый уровень понимание роли днРНК в патогенности, регуляции генов и половой дифференциации, открывая новые возможности для таргетных терапевтических стратегий против смертельного малярийного паразита.

Малярия – инфекционное заболевание, передающееся комарами, вызывается простейшими паразитами рода Plasmodium. Среди видов, заражающих человека, Plasmodium falciparum является наиболее распространенным и смертоносным: по оценкам, в 2020 году от него погибло 627 000 человек1. Этот паразит имеет сложный жизненный цикл, включающий несколько биологических стадий как у человека, так и у комаров-хозяев. Поскольку спорозоиты передаются от комара, инфицированного плазмодием, в кровоток человека, они мигрируют в печень, проникая в гепатоциты и инициируя амплификацию паразита. После этого преэритроцитарного цикла, который может длиться от 7 до 10 дней, в кровоток высвобождаются десятки тысяч инфекционных мерозоитов, которые проникают в эритроциты. Внутри эритроцита паразит созревает от кольца до трофозоита и до многоядерных стадий шизонта. Через 48 ч новообразованные мерозоиты вырываются из эритроцита и повторно заражают новые эритроциты. Этот разрыв обычно сопровождается клиническими симптомами. Во время этого внутриэритроцитарного цикла развития часть паразитов может дифференцироваться в мужские и женские гаметоциты. Попав в организм самки комара Anopheles во время еды с кровью, эти гаметоциты подвергаются половой репликации внутри кишечника комара, образуя зиготу, которая может дифференцироваться в подвижную оокинету и ооцисту. Ооциста будет расти и производить тысячи новых спорозоитов, которые мигрируют в слюнные железы комара, готовые заразить нового человека-хозяина во время последующего приема крови. Этот многоэтапный жизненный цикл развития приводит к отчетливым морфологическим и физиологическим изменениям в ответ на измененные условия окружающей среды и жестко регулируется скоординированными изменениями в экспрессии генов.

Профилирование экспрессии генов2,3, включая эксперименты по массовому секвенированию РНК2,4,5,6,7, профили экспрессии зарождающихся РНК8, а также секвенирование отдельных клеток9, показало, что большинство генов паразита транскрибируются в каскаде экспрессии генов. на протяжении всего жизненного цикла паразита, но точные молекулярные механизмы, регулирующие эти события, в значительной степени неизвестны.

По сравнению с другими эукариотами с аналогичным размером генома, P. falciparum имеет чрезвычайно богатый АТ геном и относительно небольшое количество последовательно-специфичных транскрипционных факторов (ТФ), что составляет примерно две трети ожидаемых ТФ, исходя из размера генома. . Только 27 ДНК-связывающих белков apicomplexan apetala2 (ApiAP2) были идентифицированы как специфические ТФ в геноме паразита. Эти ApiAP2 уникальны для Apicomplexa10 и, как было показано, играют важную роль в качестве активаторов или репрессоров транскрипции11. Наше понимание регуляции этих ТФ и того, как различные ТФ могут действовать вместе для организации транскрипционных сетей, все еще ограничено, но наблюдаемые закономерности экспрессии генов, вероятно, являются результатом комбинации транскрипционных9,12,13,14 и посттранскрипционных процессов. регуляторные мероприятия15,16,17,18. Кроме того, эпигенетические исследования19,20,21,22,23,24,25 и методы захвата конформации хромосом (Hi-C)26,27,28 показали, что состояние хроматина и трехмерная (3D) структура генома P. falciparum тесно связаны с транскрипционной активностью семейств генов28. Алгоритмы машинного обучения также предположили, что TF ApiAP2 действительно могут работать в сочетании с эпигенетическими факторами29. Однако то, как все регуляторы транскрипции рекрутируются в свои ДНК-связывающие мотивы и области хроматина, еще предстоит выяснить. Понимание точных механизмов, регулирующих жизненный цикл репликации паразита, имеет важное значение, если мы хотим определить новые терапевтические цели.

2500 lncRNA candidates, including 1300 circular lncRNAs51,52,53,55,56. These initial studies confirmed that parasite lncRNAs are developmentally regulated but only a few of these annotated ncRNAs have been functionally characterized. Some have been linked to regulation of virulence genes57,58,59,60,61,62. It has also been established that GC-rich ncRNAs serve as epigenetic regulatory elements that play a role in activating var gene transcription as well as several other clonally variant gene families63. In addition, a family of twenty-two lncRNAs transcribed from the telomere-associated repetitive elements (TAREs) has been identified in the parasite45,47,59. These TARE-lncRNAs show functional similarities to the eukaryotic family of non-coding RNAs involved in telomere and heterochromatin maintenance64 and could have a role in regulating virulence factors. More recently, the functional characterization of two lncRNAs, gdv1-as-lncRNA and md1-lncRNA that were detected during gametocytogenesis, has revealed that sexual differentiation and sex determination in P. falciparum is at least partially regulated by lncRNAs65,66. While it is becoming evident that lncRNAs serve as an integral part of the mechanisms regulating gene expression in Plasmodium, the localization and function of most of the identified lncRNAs remain a mystery./p> or <0.5 of summed nuclear vs cytoplasmic expression level. Density plots of size (b) and GC content (c) of lncRNA candidates and annotated protein encoding mRNAs (purple). d Expression levels of primary transcripts (left), steady-state RNA (middle) of lncRNA candidates and annotated protein encoding mRNAs for Ring (R), Trophozoite (T), Schizont (S) and Late Gametocyte (LG) stages. e Relative stability of lncRNA candidates and annotated protein encoding mRNAs. The stability is based on the ratio of RNA-seq/GRO-seq transcript level. Each box represents the 25/75 percentiles, the line across the box represents the median, and the whiskers represent maximum and minimum values. Outliers are indicated with dots./p> 500 mature gametocytes). Significance of the results was calculated using the two-way ANOVA with Holm-Šídák correction (**p < 0.01, ***p < 0.001). c Exflagellation assays were performed and the number of exflagellation centers per field (n > 10) were counted. Shown are results from two biological replicates. Bars indicate the mean. (d&e) Mosquito passage: Gametocyte cultures were fed to Anopheles stephensi mosquitoes. On day 11 post-infection, midguts were removed, and oocysts were counted (d) and on day 17 post-infection salivary glands were harvested and sporozoites were counted (e). Data are pooled from 2 biological replicates. Oocyst counts were performed with 15–25 mosquito midguts per experiment. Significance of the results was calculated using the Kruskal-Wallis test with Dunn’s post-test (****p < 0.0001). For salivary gland sporozoite counts, salivary glands from 20 mosquitoes were harvested, homogenized and sporozoites counted using a hemocytometer. Shown is the average number of salivary gland sporozoites for each of two experiments. Significance was calculated using the Chi-Squared tests (****p < 0.0001). f Volcano plots for gene expression profile between the WT and ΔlncRNA-ch14 lines by –Log10 P (y-axis) and log2 Fold change (x-axis) in asexual stage parasites (Top) and in mature gametocytes (Bottom). NS: Non-significant; FC: Fold Change. g Bar graph representations of selected Gene Ontology (GO) enrichment of downregulated genes between WT and ΔlncRNA-ch14 lines are presented by Log10 P (y-axis) in asexual mature (Left) and mature gametocyte (Right) stages. Exact p values and raw data are indicated in the Source data file./p>

0.2. Cells identified as an early/late ring or late schizont containing <50 UMI/cell and <50 genes/cell were removed due to poor quality. Cells mapped to late stages, or cells not assigned to a stage in the Malaria Cell Atlas were removed if they contained <100 UMIs/cell or <80 genes/cell. Data from days 4, 6 and 10 were integrated together using Seurat’s IntegrateData function using 2000 integration anchors and 10 significant principal components. A variance stabilizing transformation was performed on the integrated matrix to identify the 750 most highly variable coding genes, and these were used to perform a principal component (PC) analysis. Significant PCs were then used to calculate three-dimensional UMAP embeddings using only coding genes. LncRNA expression was visualized on the UMAP embedding generated from coding gene expression using the package ggplot2 to assign stage-specific expression for the lncRNA./p>